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　　臭氧是地球低层大气中一种典型的有害污染物，但叶际微生物群在大气污染修复方面具有广阔的应用前景。尽管有研究探索臭氧叶际修复的效率和机制，但叶际微生物组的反应和作用仍然未被研究。本研究将冬青卫矛(Euonymus japonicus)暴露于不同的臭氧水平，揭示了暴露期间叶际微生物群落的演替和作用。与其他环境因素相比，低水平暴露(156 ± 20 ppb)引起的反应有限。尽管真菌数量稳定，但未能维持群落的丰富度和多样性，而细菌则出现了丰度的损失。随后将暴露水平提高到5000 ~ 10000 ppb，细菌和真菌的多样性发生了显著变化。本研究发现了极端耐受物种，包括细菌属(Curtobacterium、Marmoricola和Microbacterium)和真菌属(Cladosporium和Alternaria)。物种组成差异表明，大多数核心真菌类群与植物病害和生物防治有关，臭氧暴露可能会增强这种拮抗作用，从而可能影响植物健康和臭氧修复。病原体占优势的功能预测进一步证实了这一假设。本研究揭示了微生物对臭氧暴露的响应，并为通过微生物作用加强臭氧叶际修复提供了启示。

　　利用冬青卫矛叶片在准密封室内进行臭氧修复。实验持续120分钟，采样间隔15分钟。在连续产生臭氧的前60分钟(图1)，没有冬青卫矛的室内臭氧浓度在45分钟后达到375 ppb的峰值，然后下降到88 ppb。在冬青卫矛存在的情况下，臭氧水平在60分钟后达到231 ppb的峰值，15分钟后降至标准(102 ppb)，随后降至检测下限。盆栽和土壤的清除主要取决于周围薄膜和盆栽表面的物理沉积。加入冬青卫矛后，物理沉积大大增强，其中气孔起着关键作用。植物倾向于释放生物挥发性有机化合物(BVOCs)以产生臭氧，在短试验期内，这一点可以忽略不计。冬青卫矛在植物和微生物群的促进下表现出极好的臭氧去除潜力，但各自的贡献尚不清楚。

　　图1. 密封室内臭氧水平的时间过程。处理包括盆栽土壤和盆栽土壤加冬青卫矛，均覆盖铝箔。臭氧产生持续60分钟，误差条代表标准差(n=3)。虚线表示《臭氧浓度限值》(GB3095-1996)。

　　为了进一步挖掘微生物的潜力，我们进行了臭氧暴九游会股份有限公司露。在低水平暴露(100~300 ppb)期间，叶际细菌和真菌对群落结构的反应不同。结合图S2中16S及其区域(每克叶片)的拷贝数和图2中的α多样性指数进行定量和定性分析。与相应的对照组相比，16S rDNA浓度水平显著下降了约43.6%和72.1%。同时，图2A中的OTU数和Shannon指数几乎保持不变，而Heip指数在暴露10天后从0.099降至0.031，但随后又恢复到原始水平。这些趋势表明，叶面细菌最初经历了丰度和均匀度的下降，但在实验期间适应了低水平暴露。另一方面，真菌的浓度变化不显著(图2B)，但以较低的丰度(暴露28天后OTU数为527~329)、Shannon多样性(暴露28天后Shannon指数为2.8~1.7)和均匀度(暴露10天后Heip值为5.3~3.7)为代价。与细菌不同，尽管真菌的数量持续稳定，但从长远来看，真菌无法维持群落的丰富度和多样性。上述结论与其他研究一致，磷脂脂肪酸(PFLA)分析表明臭氧暴露降低了非根际土壤中的总生物量、细菌生物量和真菌生物量，真菌在暴露期间似乎更敏感。然而，土壤中的研究结果可能提供的参考有限，因为凋落物和养分分布等现象不适用于叶际。 在臭氧暴露期间，微生物组成同时发生变化。对于细菌门(图S5A)，在暴露10天后，放线菌(Actinobacteriota)的相对丰度从58.7%增加到77.0%(p 0.05)，这表明对照组(79.1%)和暴露组(73.4%)在18天后的差异不明显(p 0.05)。变形菌(Proteobacteria)也显示了类似的趋势(p 0.05)，表明低水平的臭氧胁迫造成的影响有限。值得注意的是，厚壁菌门(Firmicutes)在10天后显著增强(p 0.05)。真菌的组成较简单，只有两个优势门，子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)，随着实验的进行，子囊菌门获得了更高的优势(75.3~96.2%，p = 0.05)。总体而言，在臭氧胁迫下，细菌和真菌在门水平上的组成变化不大，然而，令人惊讶的是，采样时间导致了更多的变化。在柑橘树的臭氧暴露中也有类似的观察结果，与臭氧处理相比，室内的环境差异产生了更显著的影响。其他关键决定因素，如营养物质的可用性或气象条件，可能会超过臭氧暴露。 在属水平上，优势类群通常保持优势。图3A、B中列出了前15个细菌属的相对丰度，分别表示臭氧暴露10天和28天的影响。在整个实验过程中，短小杆菌属(Curtobacterium)是最丰富的一个属，首先从27.8%增加到45.5%，然后从26.8%下降到16.2%。短小杆菌属物种主要存在于叶际，并发挥各种生态作用，如病原体和内生共生体。多功能性和内生性可能是其抗性的原因。在暴露期间，甲基杆菌(Methylobacterium)的生长受到抑制，表明其对臭氧敏感，而Masilia和Hymenobacter呈现出类似的趋势。Hymenobacter能适应城市环境和强紫外线辐射的生境。它显示了利用真菌碳的潜力，但这些有利的特性似乎不足以对抗目前的臭氧胁迫。相比之下，在暴露10天或28天后，芽孢杆菌(Bacillus)、Exiguobacterium、Phycicoccus和Frigoribacterium的丰度分别显著增加6.9%、1.2%、5.6%和1.1%。Exiguobacterium是一种多用途的细菌属，具有促进植物生长和农业生产的潜力。Phycicoccus物种可能含有缓解植物相关环境中压力的假定基因。 线C、D所示，变化不明显。绝对优势属Cladosporium进一步增强，并在28天后达到70.9%的峰值。值得注意的是，这种增强归因于臭氧输入以外的因素，对照组的丰度同时增加证明了这一点。Cladosporium包括常见的内生真菌、植物病原体和真菌重寄生菌，而某些物种被证明是植物疾病的潜在生物防治剂。Zymoseptoria、Gibberella、Acremonium和Ramularia呈现不同程度的上升趋势，而Golubevia、Cystobasidium、Phaeosphaeria、Pseudocercospora和Hansfordia的生长受到显著限制，尤其是Hansfordia(几乎灭绝)。小麦叶枯病菌(Zymoseptoria tritici)是引起小麦叶斑病的一种半营养致病菌。Golubevia物种是植物病原体的生物防治剂，其减少可能有利于病原菌入侵。Pseudocercospora是一种引起叶斑的植物病原体，在臭氧暴露期间几乎被消灭。发现Hansfordia寄生于番茄叶霉和Cladosporium cladosporioides。大多数核心真菌类群都与植物病害有关，无论是病原菌还是生防菌，这些病害很可能会因臭氧过剩和密封条件而加剧。物种间这种不同的敏感性可能导致在叶际中潜在的生物控制损失或增强。

　　图2. 低水平臭氧暴露期间叶际细菌(A)和真菌(B)群落的α多样性变化。OTU数、Shannon和Heip是列出的三个估计值，误差条代表标准差(n=3)。不同字母表示显著差异(LSD检验，p 0.05)

　　图3. 低水平臭氧暴露期间叶际微生物组成的演替。暴露10天(A)和28天(B)后的细菌组成变化，以及暴露10天(C)和28天(D)后的真菌组成变化。误差条代表重复的标准差(n=3)。通过Mann–Whitney–Wilcoxon(MWW)检验计算p值(*0.01 p ≤ 0.05)。

　　对冬青卫矛进行了短期高水平和超高水平臭氧暴露。物种多样性的变化如图4所示。暴露于高水平臭氧导致的模式与低水平臭氧相反。叶际真菌几乎没有变化，而细菌的丰富度、多样性和均匀度分别下降了46.2%、26.6%和53.3%。相比之下，5天的超高水平臭氧暴露破坏了细菌和真菌多样性，尤其是丰富度和均匀度。与真菌相比，叶际细菌群落对急性臭氧胁迫高度敏感。尽管真菌对高水平臭氧暴露具有耐受性，但在超高水平臭氧的作用下，真菌群落也明显恶化。观察到群落结构变化并不令人惊讶，因为大量研究证明了直接暴露于高水平臭氧的致命影响。高水平暴露九游会股份有限公司时真菌耐受性显著可能与暴露时间相对较短有关。 根据图S6A中的门水平物种组成，除了放线)，其他门水平物种丰度都有着不同程度的下降。超高剂量暴露期间的变化模式相似。大多数放线菌都是腐生菌，只有一小部分是植物病原菌。叶际真菌由子囊菌和担子菌组成，子囊菌在臭氧暴露的第3天和第5天分别增加了21.3%(p 0.05)和27.0%(p 0.05)。子囊菌是种类最多的真菌类群，以各种营养模式生活，对外界干扰表现出显著的耐受性。

　　图4. (超)高水平臭氧暴露期间叶际细菌(A)和真菌(B)群落的α多样性变化。OTU数、Shannon和Heip用误差条表示标准差(n=3)。不同字母表示显著差异(LSD检验，p 0.05)。

　　高水平臭氧暴露在属水平上引起了明显的变化。在高水平暴露期间(图5A，B)，前15个丰富细菌属中有近一半丰度增加，其余则减少，导致细菌多样性的变化不显著。值得注意的是， Curtobacterium和Marmoricola的相对丰度分别从9.1%上升到40.8%和1.5%上升到4.7%。相反，甲基杆菌属(Methylobacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、微小杆菌属(Exiguobacterium)和不动杆菌属(Acinetobacter)的丰度分别下降了10.0%、6.5%、2.6%和5.0%。其中，不动杆菌属在臭氧胁迫下几乎灭绝。Marmoricola对长期烟雾污染有很强的耐受性。葡萄球菌通过伤口感染、肺炎等被确定为人类病原菌。有趣的是，局部臭氧疗法被用于缓解葡萄球菌引起的特应性皮炎，其中不动杆菌可能是益生菌。与当前观测结果不一致可能与臭氧强度有关。

　　叶际真菌的反应更明显，因为链格孢菌(Alternaria)以27.3%的相对丰度超过Cladosporium，在叶际真菌中占主导地位。类似地， Didymella、Aschersonia和Epicoccum分别增加了5.5%、2.8%和1.2%。同时，大多数属在臭氧胁迫下受到严重抑制，几乎灭绝，以Symmetrospora、Zymoseptoria、Golubevia和Lectera为代表，表明它们对臭氧的高度敏感性。Didymella包含几种严重的植物致病菌以及作物上的内生和腐生物种。Aschersonia已显示出作为害虫防治剂的潜力。Epicoccum可能作为植物病原体，但一些内生物种与生物防治有关。这些核心类群再次证明，臭氧可能增强了与植物疾病相关的拮抗作用。 随后，我们将暴露水平提高到10000 ppb，并在叶际细菌(图5C)和线D)组成中观察到不同的变化模式。例如，细菌属Sanguibacter、泛菌属(Pantoea)、Leucobacter和Cedecea从臭氧输入中受益，丰度分别增加了6.8%、3.6%、5.6%和2.8%。泛菌属(Pantoea)最初被认为是植物病原体，但随后与人类感染和生物控制产品有关。Leucobacter曾从马铃薯叶际中分离出来，但相关性状和相互作用仍不清楚。超高水平暴露5天后的真菌群落以Cladosporium(40.8%)和链格孢菌(Alternaria)(32.2%)为主，其他种群的资源有限，导致多样性和丰富度降低(图5B)。值得注意的是，Cladosporium在超高臭氧胁迫下比在高浓度暴露下获得更多优势，Gibellulopsis也表现出类似的上升趋势，从0.4%上升到6.0%。另一方面，以Didymella和Aschersonia为代表的几个抗性属因暴露强度的增加而受到严重抑制，这表明臭氧的二元性和最佳浓度。 (超)高暴露不可避免地改变了微生物的功能。基于KEGG的功能注释(图6A)显示，细菌功能主要包括氨基酸代谢(13.1% ± 0.4%，平均值±标准差，n=9)、碳水化合物代谢(12.9 ± 0.2%)和膜转运(11.4% ± 0.1%)。据报道，这些基本途径促进能量供应，维持细胞功能，并在外部胁迫下采取防御策略。在暴露过程中，除了高水平(7.7%)和超高水平(8.1%)的主动信号转导相比于自然叶际(6.6%)，细菌功能没有显著变化。信号转导是细胞外信使与细胞表面受体的结合转化为细胞反应变化的过程。受臭氧胁迫的刺激，通过交叉调节、生物膜形成等由一个双组分信号转导系统控制。相反，在臭氧暴露期间，真菌群发生了显著变化(图6B)。动物和植物病原体在胁迫下激增，而腐生菌主要减少，表明病原菌占优势，植物健康状况恶化。

　　图5. (超)高水平臭氧暴露期间叶际中的微生物变化。高水平暴露：细菌(A)和真菌(B)群落组成；超高水平暴露：细菌(C)和真菌(D)群落组成。误差条代表重复的标准差(n=3)。通过Mann–Whitney–Wilcoxon(MWW)检验计算p值(*0.01 p ≤0.05)。

　　图6. 不同处理之间的功能预测和比较：(A)基于Tax4Fun的主要2级KEGG orthology相对丰度(%)；(B) FUNGuild筛选的主要真菌功能群的相对丰度(%)。数值表示为平均值(n=3)。

　　本研究通过测试冬青卫矛的叶际修复效率，证明它是一种不错的植物材料。低水平臭氧暴露(156 ± 20 ppb)在其他因素的干扰下(尤其是植物生长期)，对叶际微生物组的影响不显著。细菌和真菌表现出不同的反应模式。虽然真菌未能维持群落的丰富度和多样性，但丰度保持不变，而细菌则表现出相反的趋势。高达5000~10000 ppb的高暴露水平在短时间内显著改变了细菌和真菌群落，突出了极端耐受性物种，包括细菌属(Curtobacterium、Marmoricola和Microbacterium)和真菌属(Cladosporium和Alternaria)。大多数核心真菌类群与植物病原菌(如Zymoseptoria)和生防菌(如Golubevia)有关，形成了拮抗关系，可能影响植物健康和臭氧吸收。功能分析表明，细菌的防御机制可能与信号转导有关，在臭氧胁迫下，病原真菌占优势，对植物健康构成威胁。考虑到臭氧威胁和可持续解决方案的迫切需要，我们的研究结果尤其重要。叶际微生物群与臭氧之间的详细反应需要基因水平的进一步数据。